Fluctuatietest

Dit practicum werd voorgesteld door Prof. dr. Luc Leyns (VUB) op het Vlaams Congres voor Leraars Wetenschappen - 2016.
Bewerking voor deze website door Victor Rasquin.

Een protocol voor de leerkracht met opdrachten voor de leerlingen kan gedownload worden in MS-Word .docx formaat of in pdf.

Inleiding

Wanneer een populatie van bacteriën blootgesteld wordt aan een agens dat de meeste bacteriën doodt, bijvoorbeeld een antibioticum, neemt men meestal waar dat een kleine fractie van de populatie deze selectie overleeft. Dit zijn varianten die resistent geworden zijn tegen het antibioticum.

Oorspronkelijk werden er twee hypothesen voorgesteld om het ontstaan van deze resistente varianten te verklaren.

1. Volgens de adaptatiehypothese kan iedere cel, met een gelijke en lage waarschijnlijkheid, door het antibioticum er toe aangezet worden om zich aan te passen, zodat de cel kan overleven in aanwezigheid van het antibioticum. Deze adaptatie wordt dan overgedragen op de nakomelingen.

Figuur 1. Adaptatiehypothese (Directed Mutation Model).
De resistente cellen (in rood) hebben zich aangepast als reactie op het toegevoegde antibioticum (de gestippelde rode lijn).

2. Volgens de spontane mutatie hypothese kan elke cel met een lage waarschijnlijkheid muteren van gevoeligheid voor het antibioticum naar resistentie ertegen. De aanwezigheid van het antibioticum is hiervoor niet nodig.

Figuur 2. Spontane mutatie hypothese
De resistente cellen (in rood) hebben zich reeds aangepast vóór het toevoegen van het antibioticum (de gestippelde rode lijn) .

Beide hypothesen worden hier experimenteel onderzocht door de variantie te vergelijken tussen:

1. het aantal resistente kolonies die men verkrijgt wanneer stalen uit verschillende culturen worden uitgeplaat op petrischalen met de variantie van
2. het aantal resistente kolonies bij uitplaten van stalen uit dezelfde cultuur.

De fluctuatietest

In 1943 beschreven Luria en Delbrück (S. Luria & M. Delbrück, 1943, Genetics 28: 491-51) een elegante test (de fluctuatietest) om een onderscheid te maken tussen deze twee hypotheses.

Bacteriën reproduceren zich door aseksuele splitsing. Hierdoor kunnen we de groei van de bacteriële populatie als een vertakking voorstellen, waar de takken van de moedercellen verbonden zijn met de dochtercellen (zoals in figuur 1 en 2). Luria en Delbrück realiseerden zich dat er belangrijke informatie kon gehaald worden uit een experiment als verschillende (kopieën van) bacteriële culturen simultaan werden gebruikt.

Volgens de adaptatiehypothese is de bacteriële populatie homogeen gevoelig vóór deze met het antibioticum in contact komt. De waarschijnlijkheid dat een cel bij contact met het antibioticum resistent wordt is voor elke cel gelijk. Deze hypothese voorspelt dus geen grote verschillen tussen de aantallen resistente bacteriën in verschillende culturen.

Volgens de spontane mutatie hypothese is de populatie echter niet homogeen, vermits de mutatie naar resistentie tijdens de groei van de cultuur met een lage waarschijnlijkheid in elke cel kan optreden. Het aantal resistente bacteriën in een cultuur hangt dus af van het feit of de eerste mutatie naar resistentie vroeg, dan wel laat optreedt tijdens de groei van de cultuur. Daarom zijn er grotere verschillen tussen de aantallen resistente mutanten in verschillende gelijktijdig gegroeide culturen dan tussen stalen genomen uit dezelfde cultuur.

Doel van het practicum

Deze hypothesen kunnen experimenteel onderzocht worden door de variantie te vergelijken tussen

1. het aantal resistente kolonies die men verkrijgt wanneer stalen uit verschillende culturen worden uitgeplaat met de variantie van
2. het aantal resistente kolonies bij uitplaten van stalen uit eenzelfde cultuur.

De spontane mutatie hypothese voorspelt een grotere spreiding van het aantal resistente kolonies dan de adaptatiehypothese. Dit kan nagegaan worden door berekening van de variantie aan de hand van de formule:

Variantie =   Σ(x  -­  µ)² / n  -­  1

waarin:

x = waargenomen aantal resistente mutanten in elk staal
μ = gemiddeld aantal resistente mutanten in de 10 stalen
n = aantal stalen

Tijdens dit practicum ontvangen de leerlingen 10 monsters van een kolonie E. coli, opgegroeid in de afwezigheid van een antibioticum. Zij zullen deze populaties uitplaten op agar-platen waaraan het antibioticum rifampicine is toegevoegd. Enkel rifampicine resistente cellen (rifR) zullen kolonies vormen op de agar-platen.

Aan de hand van het aantal gevormde kolonies kunnen de leerlingen de variantie bepalen om zo een onderscheid te maken tussen de adaptatiehypothese en de spontane mutatie hypothese.

De gebruikte bacteriestam CSH117 van E. Coli kan via mail besteld worden bij Prof. Luc Leyns (lleyns@vub.ac.be)

Experimenteel materiaal dat op voorhand moet voorbereid worden

Voor te bereiden door de leerkracht (eventueel m.b.v. enkele leerlingen).

Deze technieken zijn aangepast voor labo's met weinig uitrusting. Ze volgen dus niet altijd de beste laboratoriumpraktijkregels (bv. in verband met sterilisatie), maar in deze situatie ze zijn goed genoeg.

Indien er beter materiaal beschikbaar is (zoals autoclaaf, roerder, 37° incubator, regelbare micropipetten, enz.), liefst deze te gebruiken.

Minimale uitrusting:

• een kookpan (liefst een snelkookpan) om medium te koken en te steriliseren.
• een oven om glaswerk te steriliseren.
• bunsenbranders.

Koken en steriliseren kunnen op een gewoon fornuis (bv. thuis) gedaan worden. Er is geen risico om iets te contamineren.

Bereiding van LB medium

Reken ongeveer 25 mL van deze kweekbouillon per experimentele groep (van bv. 2 leerlingen per groep) plus extra 25 mL voor het voorbereidend werk.

Bereid het gewenste volume van LB medium voor door 20 gr LB broth poeder toe te voegen aan 1 liter water.
Gebruik hiervoor liefst een labofles; indien dit niet mogelijk is: een erlenmeyer.
Meng zeer goed tot er geen klonters meer zijn (gebruik een spatel).
Plaats aluminiumfolie op het deksel van de fles of op de hals van de erlenmeyer. Steriliseer het medium onmiddellijk.
Eens terug op kamertemperatuur kan het in een frigo bewaard worden (voor een paar dagen tot een paar maanden afhankelijk van de kook-/sterilisatietechniek).

Bereiding LB met agar (voor petriplaten)

Bereid het gewenste volume (hier 50 mL) van LB-Agar medium voor door 1 gr LB broth poeder en 0,75 gr van agar (1,5% finale concentratie) toe te voegen aan 50 mL water. Gebruik liefst een labofles, indien dit niet mogelijk is een erlenmeyer.
Meng zeer goed tot er geen klonters meer zijn.
Plaats aluminiumfolie op het deksel van de fles of op de hals van de erlenmeyer. Steriliseer het medium onmiddellijk (zie beneden).

Laat afkoelen totdat je de fles met je handen kan aanraken/vastnemen (bijna te warm, daardoor de handschoenen, maar niet kokend). Let op, laat het koelen op een onderzetter, niet op een koud oppervlak.
Meng voorzichtig door licht te draaien met de fles ("swirling")
Neem het deksel/de aluminiumfolie weg en giet in een petrischaal totdat de volledige oppervlakte bedekt is. Plaats het deksel terug en ga verder met de andere petrischalen.
Onmiddellijk daarna, giet (liefst warm) water in je fles vóórdat de resterende agar stolt in de fles. Indien dit toch gebeurt, kan je de agar schrapen met een spatel en alles goed naspoelen met kokende water.

Bereiding van een stock-oplossing van 50mg/mL Rifampicine

Gebruik labohandschoenen voor deze handeling. Werk - indien mogelijk - in een trekkast.
Dimethylsulfoxide (DMSO) heeft een lage toxiciteit maar wordt snel opgenomen door de huid. Laat leerlingen dit deel niet doen.

• Maak een stock van 50mg/mL in een buis/flesje dat goed dicht kan. Los hiertoe 300 mg Rifampicine op in 6 mL DMSO. Je bekomt een rode oplossing. Deze stock is 500x geconcentreerd; 1 mL is dus goed voor 500 mL LB met agar + Rifampicine.
• Bescherm deze stock tegen het licht met aluminiumfolie en bewaar hem in de frigo.
• Maak jaarlijks eennieuwe stock.

Bereiding petriplaten LB met agar + Rifampicine (Petriplaten Rif100)

Per experimentele groep (bv. 2 leerlingen per groep) heb je 20 Rif100 petriplaten nodig, dus ongeveer 200-300 mL per groep.

• Bereid het gewenste volume van LB-Agar medium door 20 gr LB broth poeder en 15 gr agar toe te voegen aan 1 L water.
• Gebruik hiervoor liefst labo flessen; indien dit niet mogelijk is: erlenmeyers.
• Meng zeer goed tot er geen klonters meer zijn.
• Plaats aluminiumfolie op het deksel van de fles of op de hals van de erlenmeyer
• Steriliseer het medium onmiddellijk (zie beneden).
• Laat het afkoelen tot je de fles met je handen kan aanraken/vastnemen (bijna te warm, daardoor de handschoenen, maar niet kokend). Let op, laat het koelen op een onderzetter, niet op een koude oppervlakte.
• Pas dan voeg je Rifampicine toe: 2 mL van de stock-oplossing per liter LB-Agar —> de eindconcentratie van Rifampicine is dus 100 mg/L
• Meng goed maar voorzichtig door roterende bewegingen te maken.
• Neem het deksel/de aluminiumfolie weg en giet in een petrischaal totdat de volledige oppervlakte bedekt is.
• Plaats het deksel terug en ga verder met de andere platen.

Onmiddellijk daarna direct warm water in de fles gieten vóórdat de restant agar stolt. Indien dit toch gebeurt, kun je de agar los schrapen met een spatel en alles goed spoelen met kokende water.

Let op: markeer de Rif100 platen met een zwarte streep op de zijkant.

Het maken en het gebruik van een entnaald

De entnaald wordt gebruikt om een klein beetje van de bacteriële stock (bacteriën bewaard in glycerol in de frigo) op te pikken en te enten op een LB-agar plaat.

Steek de tip van een pasteurpipet in het vuur van een bunsenbrander tot de opening dichtgloeit; zo bekom je een eenvoudige entnaald.

Vooraleer de entnaald te gebruiken houd je de punt (2-3 cm) enkele seconden in de vlam van een bunsenbrander om eventuele bacteriën te doden. Laat ongeveer 15 seconden afkoelen en prik vervolgens eens in de LB-agar (om verder af te afkoelen).

Dompel vervolgens de naald een keer in de bacteriële stock en breng de bacteriën volgens een zig-zag patroon op de LB plaat.

Incubeer de plaat (ondersteboven) tot kolonies zichtbaar zijn .

Aanmaken van petriplaten

Giet 10 tot 15 mL van het medium met agar in een petrischaal. Het moet ongeveer een 5-7 mm dikke laag vormen. Plaats het deksel terug en laat de agar stollen.
Eens de alles gestold is, zet je de petrischalen ondersteboven om de condensatie te verminderen.
Stapel de petrischalen en bewaar ze in een frigo (eventueel in de plastic zak van de petrischalen).

Vergeet niet de petriplaten te markeren, ofwel individueel op elke onderkant, ofwel door een streep te trekken op de zijkant van de stapel petrischalen.

Neem de petriplaten een uur voor gebruik uit de frigo om condensatie op de buitenkant te vermijden.
Verwijder eventuele waterdruppels op de binnenkant van het deksel met met een papieren zakdoekje.

Incubatie van bacteriën

De optimale incubatietemperatuur is 37°C. Indien je niet beschikt over een 37° incubator kan je incuberen op een warme plek. Let op, niet rechtstreeks op de radiator, dit is te warm. Vermijd ook direct zonlicht. Op 37° volstaat een incubatie van een twaalftal uren,ie genoeg, op kamertemperatuur bedraagt de incubatietijd 2 tot 3 dagen.

Om condensatie in de petrischalen te vermijden incubeer je ze ondersteboven.
Tijdens de incubatie in de cultuurbuizen, is het aangeraden deze periodisch te schudden om zuurstofgas beter te incorporeren.

Voor glazen buizen, gebruik een klein stuk aluminiumfolie als deksel. Voor gekocht plastieken buizen is het aangeraden om het deksel niet vast te zetten (laat het wat los), om zo zuurstof binnen te laten.

Bereiding van startculturen

Iedere experimentele groep zal 10 cultuurbuizen met gekweekte E. coli krijgen. Deze moeten voorzichtig bereid worden.

1) Neemt de bacteriële stock (bacteriën in een glycerol stock) uit de frigo. Met een entnaald strijk je de bacteriën in zig-zag patroon op een LB-Agar plaat (zonder antibioticum). Zet je stock terug in de frigo voor volgende keer. Incubeer de plaat tot je kolonies kan zien. Je kan deze plaat een 3-tal weken bewaren in de frigo.

2) Bereid een cultuurbuis met 2 mL LB (geen antibioticum) voor. Hiertoe raak je een kolonie aan met je entnaald en vervolgens dompel je de entnaald in de LB in de cultuurbuis. Schud even en neem je entnaald uit.
Incubeer de cultuurbuis (de inhoud moet volledig troebel worden). Je kan deze cultuur tot 1 week in de frigo bewaren.

3) Maak een 10-5 verdunning in een finaal volume van 30 mL LB. Hiertoe doe je eerst in 2 cultuurbuizen 6mL LB en in een kleine erlenmeyer 27 mL LB.

Neem met een pasteurpipet een beetje van de gekweekte cultuur uit stap “2” en doe twee druppels in één van de twee cultuurbuizen met 6 mL LB. (Indien je beschikt over een micropipet neem je 60 μL van de gekweekte cultuur uit stap "2").
Meng zeer goed (bv. met een andere pasteurpipet). Je hebt nu 100 x verdund

Herhaal deze stap in de tweede cultuurbuis met 6 mL LB.
Neemt 3 mL van deze laatste verdunning en doe deze in de erlenmeyer met 27 mL LB. Meng heel goed.

4) Bereid 10 cultuurbuizen (per experimentele groep) met elk 2 mL LB voor.

Voeg hiertoe 4 druppels (of 120 microliter) van de 30 mL verdunde stock aan elk cultuurbuis toe.

Incubeer de cultuurbuizen. Bewaar ze in de frigo (max 1 week) tot gebruik in het practicum. Schud de cultuurbuizen voor het gebruik om de bacteriën in suspensie te brengen.

DE EIGENLIJKE LEERLINGENPROEF

Dag 1

Maken van een L-vormige of driehoekige spatel

Dit spatel-type wordt gebruikt om bacteriën te spreiden (uit te smeren) op de voedingsbodem in de petrischaal.
Het is aangeraden een paar spatels te maken per experimentele groep, ze breken tamelijk snel.

Start met pasteurpipetten met een lange tip. Ze moeten niet steriel zijn.
Het eindresultaat is een L—vormige of driehoekige glazen spatel met een handvat (zie video).

Het vraagt wat oefening om succesvol te zijn (genoeg pasteurpipetten moeten voorzien worden). Een pincet om het glas vast te houden kan zeker helpen.

Altijd enkele minuten laten afkoelen. Nooit het glas aanraken met je hand!

Voor iedere spreiding moet de spatel gesteriliseerd worden om de bacteriën van het vorige staal te doden. Dit wordt best gedaan door de spatel voor enkele seconden te dompelen in ethanol (minstens 70%) en dan de ethanol te laten verdampen (bv. door de spatel in de lucht te laten drogen voor 30 seconden).

Gebruik NOOIT een vlam dichtbij.

Uitplaten bacteriën

Per groep ontvangen jullie

• 10 culturen van 2 mL. Deze zijn afkomstig van een cultuur van E. coli (stam CSH117).
• 20 LB Rif100 petrischalen met kweekmedium (LB voeding, agar en 100 mg/L van het antibioticum rifampicine).
• 12 steriele pasteur pipetten en een pipetteerballon.

• Plaat van elke cultuur 6 druppels (of 180 μL) uit op één LB Rif100 plaat (tip: vergeet niet de platen te labellen met een stift – schrijf alleen op de bodem van de plaat, nooit op het deksel).

• Plaat van eenzelfde cultuur 6 druppels (of 180 μL) uit op 10 LB Rif100 platen.

• Incubeer de platen overnacht bij 37°C of 2 tot 3 dagen op kamertemperatuur (tip: incubeer de platen ondersteboven om condensatie op het deksel te vermijden).

• Bewaar de platen ondersteboven in een frigo

Dag 2

Waarnemingen, berekeningen en besluiten

Tip: neem de platen een uurtje voor het practicum uit de frigo om hinderlijke condensatie tegen te gaan.

• Tel het aantal kolonies op elke plaat. Tel alle zichtbare kolonies zonder rekening te houden met hun afmetingen (zie video)
• Bereken de variantie van het aantal kolonies op de LBRif100 medium verkregen na uitplaten van een staal van elke cultuur.

• Bereken de variantie van het aantal kolonies op de LBRif100 medium verkregen na uitplaten van tien stalen uit eenzelfde cultuur.

• Vergelijk de verkregen waarden. Stemmen deze gegevens best overeen met de adaptatiehypothese of de spontane mutatie hypothese? Verklaar je antwoord.